western blot probleemoplossing

Los uw western blot-problemen op met deze tips voor het oplossen van problemen, waarbij u de veelvoorkomende oorzaken van geen signaal, hoge achtergrond, meerdere banden en meer behandelt.

1. Geen signaal
2. Hoge achtergrond.
3. Meerdere banden.
4. Ongelijke witte "vlekken" op de vlek.
5. Zwarte stippen op de vlek.
6. Witte banden op een zwarte vlek.
7. Molecuulgewichtmarkeringsstrook is zwart.

1. Waarom werkt mijn Western-blot niet??
2. Waarom is mijn Western-vlek uitgesmeerd??
3. Was je na het blokkeren van Western blot?
4. Wat veroorzaakt niet-specifieke binding bij Western blot?
5. Hoe kan ik mijn Western Blot-resultaten verbeteren??
6. Waarom gebruiken we melk in Western blot?
7. Wat zijn de stappen van Western blotting?
8. Kunt u een Western-blot overdragen??
9. Hoe bevestig je de overdracht van eiwitbanden van gel naar membraan in het Western Blot-protocol?
10. Hoe lang kun je een Western-blot blokkeren??
11. Kun je in het weekend een Western-blot blokkeren??
12. Hoe vaak kun je een Western-blot verwijderen??

Waarom werkt mijn Western-blot niet??

Als u te weinig proteïne heeft, als uw primaire antilichaam geen hoge affiniteit heeft of als uw primaire antilichaam een ​​suboptimale verdunning heeft, ziet u uw proteïne niet. Als u echter te veel proteïne laadt, kan uw signaal / ruis-verhouding omhoog gaan, waardoor de visualisatie moeilijk wordt.

Waarom is mijn Western-vlek uitgesmeerd??

Wat is de reden voor een uitstrijkje in een western blot? Zoals je kunt zien aan de ponceau-kleuring van de transfer, gaat er een uitstrijkje door de eerste 7 rijstroken. De monsters zijn embryonale stamcellen gelyseerd door 2xLSB monsterbuffer, pipetteren en koken. ... Blijkbaar is het uitstrijkje te wijten aan te veel cellen in een putje.

Was je na het blokkeren van Western blot?

Blokkering is een zeer belangrijke stap in de immunodetectiefase van Western blotting omdat het niet-specifieke binding van antilichamen aan het blottingmembraan voorkomt. Na het blokkeren wordt de vlek gespoeld in wasbuffer, meestal TBST, onder zacht schudden en in voldoende volume om de vlek ondergedompeld te houden. ...

Wat veroorzaakt niet-specifieke binding bij Western blot?

Een van de meest voorkomende oorzaken van niet-specifieke banden is onvolledige blokkering. Blokkerende buffers worden gebruikt om te voorkomen dat primaire en secundaire antilichamen binden aan het membraan of iets anders dan het eiwit van belang.

Hoe kan ik mijn Western Blot-resultaten verbeteren??

Oplossing

1. Verlaag de concentratie van primaire antilichamen.
2. Verlaag de hoeveelheid totale proteïne die op gel wordt geladen.
3. Pas de voorwaarden voor membraanblokkering aan.
4. Verhoog het aantal wasbeurten.
5. Controleer de specificiteit van het antilichaam.
6. Dep alleen met het secundaire antilichaam.
7. Als er banden ontstaan, kies dan een alternatief secundair antilichaam.

Waarom gebruiken we melk in Western blot?

Blokkeren is een zeer belangrijke stap van western blotting, omdat het voorkomt dat antilichamen niet-specifiek aan het membraan binden. Blokkering wordt vaak gemaakt met 5% BSA of magere melkpoeder verdund in TBST om de achtergrond te verminderen. ... Het antilichaam kan worden verdund in een wasbuffer, zoals PBS of TBST.

Wat zijn de stappen van Western blotting?

Er zijn vijf stappen betrokken bij de Western-blotting-procedure en -detectietest, namelijk overdracht, blokkering, incubatie van primair antilichaam, incubatie van secundair antilichaam en eiwitdetectie, en analyse van Western-blotting..

Kunt u een Western-blot overdragen??

Naarmate de tijd toeneemt, bestaat er echter een risico op overoverdracht (strippen, doorblazen) van de eiwitten door het membraan, vooral bij een lager molecuulgewicht (<30 kDa) eiwitten bij gebruik van membranen met een grotere poriegrootte (0,45 µm). Workflow van natte / tankelektrotransfer van proteïne voor western blotting.

Hoe bevestig je de overdracht van eiwitbanden van gel naar membraan in het Western Blot-protocol?

Protocol voor eiwitoverdracht

1. Bereid het PVDF-membraan voor door het 30 seconden in methanol te bevochtigen en het vervolgens kort in gedestilleerd water te laten weken, gevolgd door 1X transferbuffer. ...
2. Week filterpapier en sponzen in de transferbuffer gedurende 10 minuten voorafgaand aan montage van de transfersandwich.

Hoe lang kun je een Western-blot blokkeren??

In het algemeen mag de maximale blokkeringstijd niet langer zijn dan 2 uur bij kamertemperatuur, anders kunnen eiwitten uit het membraan worden uitgewisseld. Verdun het primaire antilichaam tot de aanbevolen concentratie / verdunning in verse blokkerende oplossing (TBS en / of PBS (PBS-tabletten 524650-1EA) / 3% magere melkpoeder).

Kun je in het weekend een Western-blot blokkeren??

Antistoffen met sterke titer werken het beste bij een korte incubatie en antilichamen tegen zwakke banden vereisen een langere incubatie (bij hogere concentratie). Het kan geen kwaad om de vlek 's nachts of in het weekend bij 4C in de blokkeerbuffer te laten.

Hoe vaak kun je een Western-blot verwijderen??

ook terwijl we proberen de primaire antilichamen te verwijderen, is het een punt om op te merken dat er een kans is dat u een deel van het eiwit dat u aan het membraan hebt gehecht of hebt overgedragen, kunt verliezen, dus het is raadzaam om het membraan niet meer dan één keer te strippen.